亚历山大在巴比伦还积极准备继续进行远征，企图进一步征服地中海西部和南印地区、北非、意大利和西班牙。但是，正在此时，亚历山大突然患恶性疟疾病逝(公元前323年6月13日)，终年33岁。显然亚历山大企图利用这支改编的军队再开展征服活动。我们知道他打算入侵阿拉伯，也许还有波斯帝国以北地区，也许打算再次入侵印度或征服罗马，迦太基和西地中海地区。

不管他的算盘如何，结果进一步的征服活动都未能进行。公元前323年6月初，亚历山大在巴比伦突然因发热而病倒，十天后就死去了。其时还不满33岁。长期以来其死因有不断的争议。大多数记载亚历山大在巴比伦的一次痛饮后，得了疟疾，除此之外伤寒也可能是另外一个凶手。还有理论认为他死于嚏根草中毒，密谋者可能包括他的妻子罗克珊娜，他的部将安提帕特以及他的老师亚里士多德。但是下毒的理论被如Robin Lane Fox质疑，因为在古希腊缺乏长作用时间的毒。

美国疾病控制和预防中心在较新出版的2004年7月号《新型传染疾病》杂志里刊登了几篇论文，讨论了“亚历山大死于西尼罗河病毒”说法。亚历山大并未留下帝位的合法继承者，与他最亲近的是一位昏弱无能的异母兄弟。传说，当他的朋友在他临死前要求他指定一位继承人时，他含糊说：“让强者继承。”于是他死后，他的将领们企图瓜分这个帝国，引发一些年轻军官对这种安排的不满，继而发生一连串的战争，在这场斗争中，亚历山大的母亲、妻子和孩子都横遭杀身之祸。

终于在公元前301年的一场决定性战役，由三位胜利者（即托勒密、塞琉古、安提柯一世（独眼的））瓜分了亚历山大帝国的版图，开启了希腊化时代。除了马其顿本土和最远的印度以外，亚洲部分由部将塞琉古继承，这就是后世和罗马的庞培、克拉苏等人征战不休的塞琉古帝国。埃及由部将托勒密继承，这就是埃及的托勒密王朝，直传到后世和凯撒结婚的埃及艳后克莉奥佩特拉为止。

安提柯一世在小亚细亚和叙利亚建立了短暂的统治，但很快就被另外四个将领击败。对印度领土的控制也只是昙花一现，当塞琉古一世被旃陀罗笈多·孔雀（孔雀王朝的第一个皇帝）击败时即归于结束。于他的英年早逝，我们有诸多推测。第一种是亚历山大死于高烧。亚历山大曾在马其顿当了13年的国王。在这长达13年的时间里，亚历山大做了许多其他国王终生都难以做到的事情。他充分地运用自己的谋略为马其顿不断的扩大领土。令人咂舌的是他建立了横跨欧洲和亚洲土地上的大帝国。

在公元前323年时，亚历山大正在准备远征之时，突然传出了亚历山大突然死亡的消息。据当时的说法，亚历山大当时被高烧折磨的长时间难以入睡。甚至当时的很多会议，亚历山大都是让人将床抬入会议室，连献祭的时候都是让人抬着出去。最终，亚历山大在失去了语言能力之后，突然去世。第二种说法，亚历山大其实是死于当时的病毒。当时的亚历山大在作战之时染上了恶性的病毒，患上了非常严重的疾病，并且在6月13日的晚上，疾病突然发作，他甚至来不及指定继承他王位的人，就不幸离世。

对于这种说法我国的历史学家吴子谨也非常认同。美国的病理研究者也同样认为亚历山大是死于病毒感染而死，这种可怕的病毒是通过蚊子来传播的，非常容易沾染上病毒。之后一种说法是，亚历山大其实是中毒死亡。亚历山大的母亲是一个生性多疑的人，在亚历山大离世五年之后，在皇室中有人传言亚历山大其实是被人毒死的。这在后来不仅仅是传言，为了调查出到底是谁害死了自己的儿子，处死了许多的人，并将当时为亚历山大调酒之人也下令处死，更加可怕的是，酒馆被处死后的骨灰都被撒如了风中。对于一介大帝的死学者们都有自己的推测和自己的观点，但事实到底是因为什么原因，如今我们已经无从考证。我们能做的，只是对他生平所创绩投去敬佩之情。

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